相衬显微镜(相差显微镜)

相衬显微镜(相差显微镜)

一、理论基础

相差是指同一光线经过折射率不同的介质其相位发生变化并产生的差异。相位指在某一时间上,光的波动所达到的位置。一般由于被检物体(如不染色的细胞)所能产生的相差太小,肉眼很难分辨,只有在变相差为振幅差(明暗差)之后才能被区分。相差决定于光波所通过介质的折射率之差及其厚度,等于折射率与厚度的乘积之差(即光程之差)。而相差显微镜就是利用被检物的光程之差进行镜检的。

细胞生物学的研究仪器中 相差显微镜,透射电子显微镜和扫描隧道电子显微镜的设计或发明获得了诺贝尔奖。[1]

相差显微镜的光路图

二、差别

相差显微镜有四个特殊结构:相差物镜、具有环状光阑的转盘聚光器、合轴调中望远镜和绿色的滤光片。绿色滤光片作用是:缩小照明光线波长范围,减少由于照明光线的波长不同引起的相位变化。

三、用途

观察未经染色的标本和活细胞。

四、基本原理

利用物体不同结构成分之间的折射率和厚度的差别,把通过物体不同部分的光程差转变为振幅(光强度)的差别,经过带有环状光阑的聚光镜和带有相位片的相差物镜实现观测的显微镜。主要用于观察活细胞或不染色的组织切片,有时也可用于观察缺少反差的染色样品。

把透过标本的可见光的光程差变成振幅差,从而提高了各种结构间的对比度,使各种结构变得清晰可见。光线透过标本后发生折射,偏离了原来的光路,同时被延迟了1/4λ(波长),如果再增加或减少1/4λ,则光程差变为1/2λ,两束光合轴后干涉加强,振幅增大或减下,提高反差。在构造上,相差显微镜有不同于普通光学显微镜4个特殊之处:

1.环形光阑(annular diaphragm) 位于光源与聚光器之间,作用是使透过聚光器的光线形成空心光锥,焦聚到标本上。

2.相位板(annular phaseplate)在物镜中加了涂有氟化镁的相位板,可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。分为两种:

(1)A+相板:将直射光推迟1/4λ,两组光波合轴后光波相加,振幅加大,标本结构比周围介质更加变亮,形成亮反差(或称负反差)。

(2)B+相板:将衍射光推迟1/4λ,两组光线合轴后光波相减,振幅变小,形成暗反差(或称正反差),结构比周围介质更加变暗。

3.合轴调节望远镜:用于调节环状光阑的像与相板共轭面完全吻合。

五、修理维护

相差显微镜使用中的几个问题:

(1)相位倒转 当n’<N或N’>N时得到象的明暗反差正好相反,称为相位倒转。当相位差Δ=0时是无法识别的,随着Δ的增大反差变大,当Δ继续增大到某一值后会出现相位倒转。用90%高吸光值(高反差)物镜时,这个转变值约为0.55Λ,用70%标准吸光值的物镜时约为0.33Λ。较高吸光值的物镜应该用于分辨较小的光程差。

(2)晕轮和渐暗效应 在相差显微镜成象过程中,某一结构由于相位的延迟而变暗时,并不是光的损失,而是光在象平面上重新分配的结果。因此在黑暗区域明显消失的光会在较暗物体的周围出现一个明亮的晕轮。这是相差显微镜的缺点,它妨碍了精细结构的观察,当环状光阑很窄时晕轮现象更为严重。相差显微镜的另一个现象是渐暗效应,指相差观察相位延迟相同的较大区域时,该区域边缘会出现反差下降。

(3)样品厚度的影响 当进行相差观察时,样品的厚度应该为5μm或者更薄,当采用较厚的样品时,样品的上层是很清楚的,深层则会模糊不清并且会产生相位移干扰及光的散射干扰。

(4)盖玻片和载玻片的影响样品一定要盖上盖上盖玻片,否则环状光阑的亮环和相板的暗环很难重合。相差观察对载玻片和盖玻片的玻璃质量也有较高的要求,当有划痕,厚薄不均或凹凸不平时会产生亮环歪斜及相位干扰。另外玻片过厚或过薄时会使环状光阑亮环变大或变小。

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