利用细胞计数板测定血细胞数量及大小

[利用细胞计数板测定血细胞数量及大小] 细胞计数是细胞培养中常用的技术,通过细胞计数可以知晓细胞的生长状态,绘制细胞生长曲线。细胞计数板是常用细胞计数的器材,具体实验步骤如下:一、 目的与要求1. 掌握用血球计数板进行细胞直接镜检计数的方法。2. 学习测量细胞大小的方法。二、 实 [血细胞计数 测微尺 细胞 物镜]

细胞计数是细胞培养中常用的技术,通过细胞计数可以知晓细胞的生长状态,绘制细胞生长曲线。细胞计数板是常用细胞计数的器材,具体实验步骤如下:

一、 目的与要求

1. 掌握用血球计数板进行细胞直接镜检计数的方法。

2. 学习测量细胞大小的方法。

二、 实验原理

动物组织细胞的体外培养、血液中血细胞数量的变动、许多产品的细菌学检查、微生物培养等科研、生产和临床上常常需要检测细胞的数量。测定细胞数量的方法有很多种,其中,用血细胞计数板于显微镜下直接计数的方法样品用量少,操作简便、快速、直观,是一种较常用的细胞计数方法。

血细胞计数板由一块长约7.5cm、宽3.5cm的厚玻璃制成,在中部1/3面积处有4条槽,内侧两条槽之间还有1条横槽相通,在中部构成2块长方形平台。此平台比整个载玻片平面低0.1mm。平台中部各有一个计数室,每个计数室分九大格,每格边长1mm,面积为1mm2,盖上盖玻片后体积为0.1mm3。四角的大格被划分为16个中方格,一般用作白细胞、血小板及组织培养的细胞计数。中央的大方格则由双线划分为25个中方格,每个中方格面积为0.04mm2,盖上盖玻片后体积为0.004mm3,每个中方格又分成16个小方格,用于红细胞、微生物细胞的计数。

细胞的大小和形态依细胞种类不同各异,通常血细胞呈椭圆形或圆球形,直径在10?m左右,按公式V=4/3?ab2(a为长半径,b为短半径)可求出细胞体积。因此,测量细胞体积首先要用测微尺测出细胞的长半径和短半径。

常用的测微尺有目镜测微尺和物镜测微尺两种。目镜测微尺为一块圆形的薄玻璃片,直径20-21mm,正好能放入目镜的镜筒内,其上面刻有不同形式的标尺。标尺有直线式和网格式两种,直线式又分为“十”字形和“一”字形两种。直线式测微尺总长10mm,分为10大格,其上有数字指示,每一大格又分10小格,共100小格。网格式测微尺常用来测量面积或计数。

物镜测微尺是一种特制的载玻片,其中央有一个圆圈,圈内具有一个有刻度的标尺,为直线式标尺,全长1mm,分为10大格,每大格又分10小格,共100小格。每小格长度为0.01mm,即10?m。

由于目镜测微尺刻度的长度随物镜放大倍数不同而有改变,所以用目镜测微尺测量细胞前,首先要测定目镜测微尺的长度,即使用物镜测微尺来确定目镜测微尺刻度的长度,然后再以目镜测微尺上的刻度作为测量细胞时的度量单位。

三、 材料和用具

显微镜、载玻片、盖玻片、血球计数板、采血针、干消毒棉球、移液器试管、滴管、目镜测微尺、物镜测微尺、计数器。

75%乙醇、红细胞稀释液、白细胞稀释液。

四、 操作与观察

(一) 血细胞计数

1. 用1mL移液器准确吸取0.38mL白细胞稀释液放入一支干净的小试管内,加塞备用。用5mL移液器准确吸取3.98mL红细胞稀释液,放入一支干净的中试管内,加塞备用。

2. 用消毒棉球蘸75%乙醇消毒左手无名指或耳垂边缘,待酒精挥发后用采血针刺入皮肤2-3mm深,让血液自然流出。(注意:必须待酒精挥发后用才能采血,否则流出的血液不成滴,无法吸取。)用干消毒棉球拭去第1滴血液,待第2滴血液成大滴时,用移液器吸20?l血,再将移液器内的血趁出血处尚有血液流出,换1个枪头用移液器吸取20?l血液放入盛有红细胞稀释液的试管底部。轻轻摇振试管1-2min,混匀稀释的血液,但不可用力过猛,以免产生泡沫。

3. 充液:用擦镜纸将计数板擦干净,盖上盖玻片。用移液器吸取20?l稀释的血液,滴在计数板上盖玻片的边缘,使其依靠毛细现象自动流入计数室内。一般应一次充液使计数室内充满稀释血液,若经几次充液,易形成气泡,应洗净计数板和盖玻片,干燥后重新充液。红细胞和白细胞应分两次充液。

4. 计数:为防止重复计数和漏数,计数时应遵循一定的顺序,对正好压在格线上的细胞,依照“数上不数下,数左不数右”的原则进行计数。如果计数白细胞时发现各大方格的白细胞相差8个以上或计数红细胞时发现各中方格的红细胞相差20个以上,表明血细胞分布不均匀,须将稀释的血液摇匀后再重新充入计数室计数。

5. 计算:

(1)白细胞数:将四角的四个大方格内数得的白细胞总数乘以50,即得每立方毫米血液内的白细胞总数。为什么?

(2)红细胞数:将中央大方格的四角和中央共五个中方格内数得的红细胞总数乘以10000,即得每立方毫米血液内的红细胞总数。为什么?

(3)按目前临床上血细胞计数采用的通用单位,将以上结果换算为每升血液中各种血细胞的数量。

将结果填入下表: 计算

次数 4个大方格白细胞数 5个中方格红细胞数

1 2 3 4 总数 1 2 3 4 5 总数

第1次

第2次

两次平均总数

血细胞计数 ×109/L ×1012/L

(二) 血细胞大小的测量

1.安装与校尺

(1)将物镜测微尺置于显微镜下(刻度面朝上),用低倍镜观察,慢慢调焦,找到物镜测微尺刻度。

(2)取下目镜,旋下目镜上盖,将圆形目镜测微尺放入镜筒中,旋上目镜盖后把目镜放回镜筒内。

(3)观察并调整目镜测微尺与物镜测微尺的位置,使两尺平行,找出两尺刻度完全重合的两个位置,记录并按下式计算:

例如,重合两处之间目镜测微尺有50小格而物镜测微尺有68小格,则目镜测微尺每格长度为68/50×10 = 13.6??m。

(4)以同法用其它物镜测定目镜测微尺每格的长度。

2. 测量细胞体积:取下物镜测微尺放入保护盒内,换上血涂片,用目镜测微尺测量红细胞和白细胞的长度与宽度,取其一半为长半径和短半径,代入公式求体积。测量完毕后小心取下目镜测微尺,包装后放回盒内。

3. 计算:V=4/3?ab2(a为长半径,b为短半径)。如果血细胞是圆球形,其体积V=4/3?R3(R为半径)。为减少误差,同一标本需测5个细胞的数据,取其平均值计算体积。

注意事项:测量细胞大小的时候,不影响更换物镜观察,如果需要更换物镜则进行测量细胞大小,则需要重新校准物镜。

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